Protocolo para a electroforese em gel de poliacrilamida

A electroforese em gel é usado no laboratório a fim de separar as proteínas ou os ácidos nucleicos a partir de cada um dos outros. A electroforese de poliacrilamida usando em vez de agarose é utilizado mais frequentemente para as proteínas para determinar as massas moleculares dos polipeptídeos da proteína . Preparação de gel de agarose

-se um gel de poliacrilamida é preparada com ranhuras na mesma. O gel é formado por vazamento de uma solução de poliacrilamida líquido quente para dentro de uma caixa rasa . A caixa deve conter uma estrutura comblike com dentes que apontam para dentro da solução . A poliacrilamida se torna um gel rapidamente após ter sido despejado e o pente são removidos para revelar orifícios rectangulares .
Dodecil sulfato de sódio ( SDS )

A proteína é tratada com dodecilsulfato de sódio ( SDS ) , a fim de desnaturar as subunidades de uma proteína grande de modo que cada um pode ser medido separadamente . As vantagens disto são que o SDS dá os polipéptidos uma carga negativa para que eles irão migrar em direcção ao terminal negativo , ou ânodo , do gel . Em segundo lugar, a SDS garante que todas as subunidades terá a mesma carga e, portanto, todos migram no gel de acordo com suas massas moleculares , em vez de encargos .
Adição de proteína

Uma pequena quantidade de DNA ou proteína é colocada em um dos furos rectangulares numa extremidade do gel . Uma corrente eléctrica é executado através do gel com um pH neutro . Cerca de 10 microlitros de uma escada de DNA , bem como dois controles , também são carregadas no gel . A escada de DNA é usado para permitir medição de quão longe a amostra mudou no processo de eletroforese .
Eletroforese

A máquina é então ligado a 100 volts e deixar correr durante 30 minutos . Depois as amostras foram sujeitas a electroforese durante 30 minutos , o gel juntamente com uma bandeja são removidos e colocados em uma bandeja de coloração durante cerca de três minutos. Esta é seguida pela colocação do gel em água quente durante cinco minutos . O gel está agora pronto para ser colocado na caixa de luz , a fim de observar o movimento dos fragmentos de DNA .
Outras considerações

Ao visualizar o gel sob a luz , algumas coisas importantes devem ser tomadas em consideração . A célula pode ser ou heterozigótica ou homozigótica para o gene , dependendo se a cópia está presente ou não presente em ambas as cópias ou em apenas uma . O resultado heterozigótica pode aparecer como uma banda única , porque os segmentos de ADN que são amplificados de forma mais eficiente aparecem mais escuras no gel . Um corante também é adicionado para cada polipeptídeo pode ser visto durante e após eletroforese .